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紫外光显微镜原理及用途

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通常所说的紫外光显微镜是使用波长在380mm-360nm以下的紫外光形成像的显微镜,这种显微镜最初是被用来增大分辨力的,在现代它主要用于对紫外光有选择吸收物质的显微分光进行光度测量。
在紫外光显微镜的应用中,首先可能会遇到的就是载玻片、盖玻片和透镜的材料问题。通常大多数的普通玻璃都会大量地吸收340nm以下波长范围的光,且紫外光不能透过玻璃透镜形成像;而且所有的透明塑料一般都具有相同的透射特性,因此也不得不使用石英、荧石或铿荧石等价格昂贵的材料,现代技术已能用这些材料制造出具有短焦距和高数值孔径的紫外光物镜。
另外,必须采用在紫外光区域能够发射足够数量辐射能的高压气体放电灯,一般白炽灯在紫外光区域内的辐射产量几乎为零。同时在紫外光显微镜中所使用的标本也必须粘在石英载玻片和石英盖玻片之间,石英载玻片比一般玻璃载玻片更小、更薄,尺寸为25mm ×37.5mm× 0.5mm,且石英盖玻片也必须比一般玻璃盖玻片薄得多,大约为0.025mm。在使用这种盖玻片时,必须先矫正紫外光物镜。更须注意的是,封藏介质和浸润液也须是能够透过紫外光的,适宜使用无水甘油。
实际上,早在1904年柯勒已制造出用于紫外光的石英物镜,这种物镜可以透过从一个弧光灯中分离的波长为275nm的紫外光,且对球面差有一定的矫正作用。使用紫外光显微镜,在分辨力上确实显示出某种程度的提高,这一点是不容置疑的。同时在使用波长为265nm的紫外光拍摄未染色的人骨髓细胞涂片时,由于细胞核中的核酸显示强烈的吸收,细胞核显示出清晰的核质结构和较高的分辨力,所以尽管照片使用了很高的放大倍数,仍不能出现空放大。
同时这里要说的是,紫外光显微镜在分辨力上的增大并不能完全令人满意。首先由于波长对场深的影响,使得分辨力的增加必须要求是很薄的物体标本。此外,在紫外光显微镜中对于色差问题的解决,近年来已取得了一些进展,主要可通过两种方法实现。
一种方法是使用反射物镜,它通常不会受到色差的损害,但对于较高孔径物镜的制造是较为困难的,另一种方法就是采用由不同的紫外光透明材料制造的折射物镜。在此,最主要的问题就在于寻找用于这种的复杂折射系统的不吸收光而且无荧光的透镜粘着剂,目前已经找到一些较为合适的粘着剂,但它们对于温度上的巨大变化也是较为灵敏的。它要求集光器和目镜必须满足不太高的光学要求,一般采用石英制造;与此同时,光源只能用气体放电灯,特殊的电弧灯虽能在紫外光的一定区域进行发射,但是往往也具有较低的光产量;除此之外滤光片和单色仪对于分离所要求的紫外光也是必需的,但同时,这也会引起光能量较大的损失。
那么,能不能使用波长比250nm-350nm的范围的远紫外光来成像呢?实际上,这种远紫外光显微镜在物理学上是有意义的,但在生物学上却没有多大的价值的,因为大多数生物学材料在紫外光范围所显示的吸收是并不处于远紫外的光谱区域的。
目前所知道的,特别是在260nm-320nm的范围内的紫外光对于许多生物学材料具有较大的影响,同时在生物界所存在的某些重要的物质又在这一光谱区域内表现出了很强的选择性吸收。所形成的在265nm波长上的反差是由于核酸的特异性吸收,蛋白质在280nm-320nm范围内也表现出选择性的吸收,这就使得使用紫外光分光光度计来进行核酸、蛋白质等物质的分布定位和定量研究进一步成为可能,更成为了紫外光显微镜的最重要、最广泛的用途。


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